2007/12/06

Hat nano trong sinh hoc va moi truong

Ứng dỤng cỦa hẠt nano ôxít sẮt tỪ đỂ tách chiẾt DNA, ĐẾM tẾ bào bẠch cẦu, và cẢi tiẾn quá trình xỬ lí nưỚc NHIỄM BẨN

Nguyễn Hoàng Hải1, Nguyễn Châu1, Nguyễn Hoàng Lương1,
Nguyễn Thị Vân Anh2, Phan Tuấn Nghĩa2, Mai Anh Tuấn3

1 Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lí, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

334 Nguyễn Trãi, Hà Nội; E-mail: nhhai@vnu.edu.vn

2 Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

3 Viện Quốc tế Đào tạo về Khoa học Vật liệu (ITIMS), Trường Đại học Bách khoa Hà Nội


TÓM TẮT

Hạt nano ôxít sắt từ có kích thước dưới 15 nm được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa được ứng dụng để: - làm giàu DNA dùng trong xác định nhanh virus bằng cảm biến sinh học; - lọc lựa tế bào để cải tiến phương pháp xác định số lượng tế bào bạch cầu CD4+ T; - gia tăng quá trình lắng đọng chất thải rắn và hấp phụ thạch tín trong nước. Hạt nano được chức năng hóa bề mặt để làm giàu DNA của virus Herpes lên hàng trăm lần làm gia tăng khả năng đo nồng độ DNA của cảm biến sinh học xuống đến thang đo nhỏ hơn nM/l. Sau khi chức năng hóa, hạt nano được bọc bằng kháng thể phát huỳnh quang antiCD4 và được dùng để đếm tế bào bạch cầu CD4+ T. Cường độ huỳnh quang của tế bào CD4+ T gắn với các hạt nano cao gấp 2,6 lần so với trường hợp chỉ dùng kháng thể huỳnh quang thông thường. Nghiên cứu này có thể được ứng dụng để điều trị bệnh nhân nhiễm HIV chỉ với một kính hiển vi huỳnh quang đơn giản. Hạt nano và phèn chua giúp quá trình lắng đọng chất rắn trong nước lên hàng chục lần và hấp thụ thạch tín. Với một lượng nhỏ hạt nano (0,25 g/l) có thể làm giảm nồng độ Asen từ 0,1 mg/l xuống thấp hơn tiêu chuẩn cho phép 0,01 mg/l của nước uống chỉ sau vài phút.

Từ khoá: Lí sinh học, hạt nano từ tính, phân tách DNA, phân tách tế bào, vật liệu nano

VẬT LIỆU NANO

Khoa học và công nghệ nano đang đi vào cuộc sống với tốc độ ngày càng nhanh là nhờ những tính chất đặc biệt của vật liệu nano. Các đặc tính của vật liệu nano có thể được chia thành hai loại: các đặc tính có liên quan đến hiệu ứng bề mặt và các hiệu ứng có liên quan đến kích thước. Hiệu ứng bề mặt có thể xảy ra ở bất kì kích thước nào, tuy nhiên, tại kích thước nano thì hiệu ứng bề mặt trở nên đáng kể. Hiệu ứng kích thước của vật liệu nano đã làm cho vật liệu này trở nên kì lạ hơn nhiều so với các vật liệu truyền thống. Đối với một vật liệu, mỗi một tính chất của vật liệu này đều có một độ dài đặc trưng. Độ dài đặc trưng của rất nhiều các tính chất của vật liệu đều rơi vào kích thước nm [1, 2]. Ở vật liệu khối, kích thước vật liệu lớn hơn nhiều lần độ dài đặc trưng này dẫn đến các tính chất vật lí đã biết. Nhưng khi kích thước của vật liệu có thể so sánh được với độ dài đặc trưng đó thì tính chất có liên quan đến độ dài đặc trưng bị thay đổi đột ngột.

VẬT LIỆU NANO Ô XÍT SẮT TỪ TÍNH VÀ ỨNG DỤNG TRONG SINH HỌC, MÔI TRƯỜNG

Đối với vật liệu từ, ngoài các tính chất “nội” đặc trưng cho từng loại vật liệu cụ thể như từ độ bão hòa Ms, dị hường từ tinh thể, cấu trúc tinh thể, các tính chất ngoại như hình dạng và kích thước tinh thể, sự sắp xếp của các tinh thể trong vật liệu cũng ảnh hưởng đáng kể đến tính chất từ. Hiệu ứng kích thước nói ở phần trên xảy ra đối với vật liệu từ tính khi mà kích thước của vật liệu nhỏ hơn kích thước đặc trưng. Với vật liệu từ, kích thước đặc trưng là độ dày vách đô men, độ dài tương tác trao đổi, quãng đường tán xạ spin của điện tử, giới hạn siêu thuận từ. Giải Nobel về vật lí năm 2007 vừa được công bố trao cho hai nhà khoa học châu Âu là Albert Fert (Pháp) và Peter Grunberg (Đức) [3] vì khám phá hiệu ứng từ điện trở khổng lồ. Ứng dụng của hiệu ứng này là các đầu đọc các ổ cứng với dung lượng rất lớn có mặt trong các máy tính ngày nay. Đây là một ví dụ điển hình về đặc tính của vật liệu nano khi mà kích thước của vật liệu nhỏ hơn quãng đường tán xạ spin của điện tử. Vật liệu ứng dụng trong sinh học yêu cầu vật liệu nano thường ở dạng hạt và phải có tính siêu thuận từ. Giới hạn siêu thuận từ phụ thuộc vào từ độ bão hòa và dị hướng từ tinh thể, trong đa số trường hợp giới hạn này từ 5 – 30 nm [4]. Vật liệu siêu thuận từ có giá trị từ độ tương đối cao và bị từ hóa mạnh dưới tác dụng của từ trường ngoài và bị khử từ hoàn toàn khi không có từ trường ngoài tác dụng (không có từ dư). Hai yếu tố trên là cần thiết đối với các ứng dụng y sinh để tránh sự kết tụ của các hạt từ trong cơ thể. Ngoài ra, độc tính, độ tương hợp sinh học (biocompatible), tính đồng nhất của kích thước hạt, ổn định trong môi trường khác nhau cũng là những vấn đề cần vượt qua [5]. Vật liệu ô xít sắt là loại vật liệu được ứng dụng nhiều nhất vì nó thỏa mãn hầu hết các yêu cầu nói trên. Trong các ô xít sắt thì magnetite Fe3O4, (Ms = 90 emu/g) maghemite g-Fe2O3 (Ms = 60 emu/g) được sử dụng nhiều nhất. Các ứng dụng của hạt nano từ tính trong sinh học bao gồm phân tách và chọn lọc tế bào, dẫn thuốc đến đích nhờ từ trường, nung nóng cục bộ nhờ từ trường ngoài xay chiều, tác nhân tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ hạt nhân. Chúng tôi quan tâm đến hai ứng dụng đầu tiên nên phần sau sẽ điểm qua tình hình nghiên cứu của phân tách và chọn lọc tế bào, dẫn thuốc đến đích nhờ từ trường.

Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác [5]. Phân tách tế bào sử dụng các hạt nanô từ tính là một trong những phương pháp được sử dụng. Quá trình phân tách được chia làm hai giai đoạn: đánh dấu thực thể sinh học cần nghiên cứu và tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường. Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nano từ tính. Hạt nano thường dùng là hạt ô-xít sắt. Các hạt này được bao phủ bởi một loại hóa chất có tính tương hợp sinh học như là dextran, polyvinyl alcohol (PVA), phosopholipids,... Hóa chất bao phủ không những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ. Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hoóc-môn, a-xít folic tìm thấy. Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên. Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các hạt từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi [6].

Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu đó là tính không đặc hiệu. Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh sẽ phân bố không tập trung nên các tế bào mạnh khỏe bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc. Chính vì thế việc dùng các hạt từ tính như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ những năm 1970 [6], những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính. Ứng dụng này mang lại hai lợi ích cơ bản: - thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; - giảm lượng thuốc điều trị. Hạt nanô từ tính có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị. Lúc này hạt nanô có tác dụng như một hạt mang. Thông thường hệ thuốc/hạt mang tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Khi các hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào một vị trí nào đó trên cơ thể. Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ. Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào. Gradient từ trường có tác dụng tập trung hệ thuốc/hạt. Hiệu quả của việc dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cường độ từ trường, gradient từ trường, thể tích và tính chất từ của hạt nanô. Các chất mang thường đi vào các tĩnh mạnh hoặc động mạch nên các thông số thủy lực như thông lượng máu, nồng độ hạt nano từ, thời gian tuần hoàn đóng vai trò quan trọng như các thống số sinh lý học như khoảng cách từ vị trí của thuốc đến nguồn từ trường, mức độ liên kết thuốc/hạt mang, và thể tích của khối u. Các hạt có kích thước mm (tạo thành từ những hạt siêu thuận từ có kích thước nhỏ hơn) hoạt động hiệu quả hơn trong hệ thống tuần hoàn đặc biệt là ở các mạch máu lớn và các động mạch. Nguồn từ trường thường là nam châm NdFeB có thể tạo ra một từ trường khoảng 0,2 T và gradient từ trường khoảng 8 T/m với động mạch đùi và khoảng 100 T/m với động mạch cổ [6]. Điều này cho thấy quá trình dẫn thuốc bằng hạt nanô từ tính có hiệu quả ở những vùng máu chảy chậm và gần nguồn từ trường. Tuy nhiên, khi các hạt nanô chuyển động ở gần thành mạch máu thì chuyển động của chúng không tuân theo định luật Stoke nên với một gradient từ trường nhỏ hơn quá trình dẫn thuốc vẫn có tác dụng. Các hạt nanô từ tính thường dùng là ôxít sắt (magnetite Fe3O4, maghemite g-Fe2O3) bao phủ xung quanh bởi một hợp chất cao phân tử có tính tương hợp sinh học như PVA, dextran hoặc silica. Chất bao phủ có tác dụng chức năng hóa bề mặt để có thể liên kết với các phân tử khác như nhóm chức amino, carboxyl, streptavidin, biotin,...

Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lí, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã triển khai nghiên cứu ứng dụng hạt nano từ tính trong y sinh học và môi trường trong thời gian khoảng hai năm trở lại đây và đã thu được một số kết quả về việc bao bọc và dung giải thuốc kháng sinh bằng hạt nano từ tính Fe3O4 [7, 8]. Hạt nano từ tính Fe3O4 được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa với kích thước 10 nm – 20 nm được chức năng hóa bằng một lớp kép gồm hai chất hai chất hoạt hóa bề mặt là oleic acid và sodium dodecyl sulfate. Khoảng giữa hai lớp phân tử trên bề mặt có tính thân dầu là nơi trú ngụ của các phân tử thuốc kháng sinh kị nước chloramphenicol. Chúng tôi đã thành công trong việc mang thuốc trên bề mặt hạt nano từ tính với hiệu suất nạp thuốc đạt hơn 3 % khối lượng. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình dung giải thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Escherichia coli (chủng DH 5a) cho thấy thuốc được dung giải nhiều nhất sau 14 giờ, ảnh hưởng kháng khuẩn của thuốc tăng 1,5 lần so với thuốc đối chứng không được mang bởi hạt nano. Kết quả cho thấy thuốc kháng sinh được mang bởi hạt nano từ tính không những có thể được điều khiển bằng từ trường ngoài mà còn kéo dài thời gian tác dụng kháng sinh nhờ lớp chất hoạt hóa bề mặt bảo vệ thuốc khỏi biến tính trong môi trường nước.

Trong bài báo này, chúng tôi tiếp tục công bố những nghiên cứu mới nhất của chúng tôi về sử dụng hạt nano từ tính để làm giàu DNA dùng trong xác định nhanh virus bằng cảm biến sinh học, lọc lựa tế bào để cải tiến phương pháp xác định số lượng tế bào bạch cầu T trong điều trị bệnh nhiễm HIV. Ngoài ra, hạt nano còn được sử dụng để gia tăng quá trình lắng đọng chất thải rắn và hấp phụ Asen trong nước.

CHẾ TẠO, CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT

Hạt nano từ tính có kích thước 10 nm – 15 nm được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa ion Fe3+ và Fe2+ bằng OH- tại nhiệt độ phòng trong môi trường khí N2 để tránh ô xi hóa. Lấy 4,17 g FeCl3.6H2O và 1.52 g FeCl2.4H2O (tức là tỉ phần mol Fe3+/Fe2+ = 2) hòa trong 80 ml nước cất hai lần (nồng độ của Fe2+ là 0.1 M) bằng máy khuấy từ. Nhỏ dung dịch này vào một dung dịch khác có chứa 6 ml NH4OH 35% với tốc độ nhỏ 1 một giọt/giây tại nhiệt độ phòng dưới điều kiện khuấy đều bằng máy khuấy từ. Kết tủa Fe3O4 màu đen được hình thành ngay khi hai dung dịch tiếp xúc với nhau. Độ lớn kích thước hạt nano có thể được điều khiển bằng tốc độ khuấy, nhiệt độ phản ứng, pH của dung dịch và nồng độ chất tham gia phản ứng. Tách lọc hạt nano từ tính bằng từ trường hoặc máy li tâm, lọc rửa sản phẩm 5 lần bằng nước để loại bỏ các hóa chất còn dư ta thu được các hạt nano từ tính tương đối đồng nhất Fe3O4 với kích thước trung bình 12 nm ± 5 nm [9]. Các kết quả nhiễu xạ tia X cho thấy khoảng 95 % số hạt có Text Box:   Hình 1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe3O4 từ tính bằng nhóm amino (Amino-NP) sử dụng APTS.cấu trúc Fe3O4, khoảng 5 % số hạt có cấu trúc g-Fe2O3 và không xuất hiện các pha khác. Kết quả nghiên cứu phổ tán xạ Raman cho thấy sau 12 giờ phơi ngoài không khí, hạt nano Fe3O4 bị chuyển hóa một phần trên bề mặt thành g-Fe2O3 rồi ổn định với cấu trúc như vậy trong thời gian vài tuần [9]. Phép đo phổ kế hồng ngoại (FTIR) cho thấy trên bề mặt hạt nano từ tính trong nước có bao phủ một lớp –OH, đây là một nhóm chức quan trọng trong việc tạo liên kết với các chất hoạt hóa bề mặt cần thiết cho các ứng dụng sinh học.

Để ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa bề mặt để có thể tiếp hợp với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể, enzyme. Các nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, steptavidin, carbonxyl, thiol. Để có được các nhóm chức ở bề mặt hạt nano, chúng tôi sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo một lớp polymer trên bề mặt hạt nano. Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là X-(CH2)n-SiRn(OR’)3-n, trong đó X là nhóm chức cần thiết để tiếp hợp các đối tượng sinh học, (CH2)n là lớp đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm này có thể dày hay mỏng, SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt nano. Alkoxysilane với rất nhiều các nhóm chức X khác nhau đã được thương mại hóa. Nhóm amino được sử dụng nhiều nhất trong các ứng dụng sinh học [10]. Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản ứng đồng thời đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm OH tự do trên bề mặt hạt nano để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững. Điều kiện môi trường phản ứng ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề mặt. Ví dụ cồn thường gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa rắn do đó làm tăng cường quá trình chức năng hóa bề mặt. Tuy nhiên cồn cũng cạnh tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro.

Chúng tôi sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS, n = 2) để tạo ra nhóm amino trên bề mặt hạt nano. Lấy 400 mg hạt nano từ tính cho vào 100 ml nước cất hai lần rồi dùng máy siêu âm phân tán hạt vào dung dịch để thu được một thể huyền phù ổn định. Nhỏ 1 ml dung dịch APTS vào trong dung dịch huyền phù nói trên và khuấy từ trong thời gian 8 giờ để quá trình chức năng hóa bề mặt xảy ra hoàn toàn. Sản phẩm thu được sau khi lọc rửa 5 lần bằng nước cất và lọc từ sẽ là hạt nano từ tính Fe3O4 có bề mặt là các nhóm amino (hình 1), viết tắt là amino-NP. Đến đây, hạt nano đã sẵn sàng tiếp hợp với các đoạn DNA của siêu vi Herpes và kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu T. Kháng thể antiCD4 là kháng thể có khả năng đối ứng với kháng Text Box:   Hình 2. Quy trình tiếp hợp hạt nano được chức năng hóa với DNA của siêu vi Herpes (hình trên chỉ mô tả chi tiết đầu 5’ của đoạn DNA dò). Phản ứng (A): hoạt hóa DNA bằng EDC. Phản ứng (B): hoạt hóa DNA bằmg MIA do EDC không ổn định trong nước. Phản ứng (C): tiếp hợp hạt nano từ tính phủ amino với DNA hoạt hóa.nguyên CD4 trên bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T. Khả năng phát huỳnh quang của kháng thể giúp việc đếm tế bào bạch cầu CD4+ T trong máu bệnh nhân bị nhiễm HIV.

LÀM GIÀU DNA CỦA SIÊU VI HERPES

Herpes là một siêu vi gây bệnh ngoài da và bệnh đường sinh dục. Đoạn mã DNA dò của siêu vi này được dùng trong nghiên cứu của chúng tôi là một đoạn mã đặc trưng 5’-AT CAC CGA CCC GGA GAG GGA C-3’ (Invitrogen). Đoạn mã sẽ lai hóa với đoạn mã đối ứng của của DNA đích của dung dịch cần làm giàu. Để DNA dò có thể tiếp hợp với amino-NP thì gốc phosphate của đầu 5’ của đoạn DNA cần được hoạt hóa. Sử dụng 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, Sigma) làm chất xúc tác cho việc hình thành liên kết giữa nhóm amino trên bề mặt hạt nano và nhóm phosphate của đầu 5’ của đoạn DNA dò (hình 2.A). Tuy nhiên, thời gian sống của EDC sau khi hoạt hóa DNA trong nước rất ngắn nên chúng tôi dùng 1-methyllmidazole (MIA) để phản ứng với EDC hình thành lên nhóm chức hoạt động khác làm cho quá trình hoạt hóa DNA trong nước được ổn định (hình 2.B). Sau quá trình này, DNA được hoạt hóa (gọi tắt là DNA hoạt hóa). Trộn amino-NP và DNA hoạt hóa thì DNA dò sẽ tiếp hợp lên bề mặt của hạt nano ta thu được hạt nano từ tính có đoạn DNA dò trên bề mặt (DNA-NP) (hình 2.C). Quá trình tiếp hợp DNA và hạt nano được ổn định ở nhiệt độ 37°C trong 18 giờ. Sản phẩm của quá trình này là hạt nano từ tính có bề mặt là các DNA dò. Các DNA-NP sẽ được dùng để làm giàu DNA của mẫu thực.

Quá trình làm giàu DNA của siêu vi Herpes bằng hạt nano từ tính được thực hiện như sau. Lấy 1 ml dung dịch chứa DNA-NP (2 % khối lượng DNA-NP/ml dung dịch) trộn với 2 ml – 20 ml dung dịch 0,1 nM/l DNA của siêu vi Herpes. Quá trình lai hóa giữa đoạn DNA dò trên bề mặt hạt nano từ tính và DNA của siêu vi xảy ra tại nhiệt độ được ổn định là 37°C trong thời gian 1 giờ. Sau phản ứng lai hóa, dùng một nam châm thương mại để cô đặc hạt nano từ tính có gắn cùng các DNA của siêu vi. Lượng DNA-NP được ước tính là dư so với số phân tử DNA có trong dung dịch. Hạt cô đặc trong tất cả các trường hợp được hòa vào trong 0,1 ml dung dịch và được gia nhiệt tại nhiệt độ 98°C để tách DNA của siêu vi ra khỏi hạt nano từ tính. Nếu quá trình tách lọc từ đạt hiệu suất 100 % thì nồng độ DNA trong dung dịch cuối cùng sẽ gia tăng từ 20 đến 200 lần. Đo nồng độ của DNA sau khi được làm giàu và tách khỏi hạt nano bằng vi cảm biến độ dẫn.

Vi cảm biến độ dẫn đo nồng độ DNA dựa trên sự thay đổi về độ dẫn ở khoảng cách giữa các điện cực khi có sự lai hóa giữa DNA đích và DNA dò [11]. Điện cực bằng đồng giống như hai chiếc lược đan xen với nhau. Kích thước mỗi răng lược 70´1000 mm2, khoảng cách giữa chúng là 30 mm. Các điện cực được cố định trên đế Si bằng phương pháp quang khắc. Khoảng trống giữa các điện cực là Si được tiếp hợp với DNA dò theo một phương pháp tương tự như phương pháp tiếp hợp hạt nano từ tính với DNA dò. Khi cho cảm biến vào dung dịch có chứa DNA Herpes, quá trình lai hóa giữa DNA dò và DNA đích xảy ra gây ra sự thay đổi về độ dẫn. So sánh với tín hiệu của một điện cực khác không được chức năng hóa bề mặt bằng DNA dò ta sẽ thu được tín hiệu đầu ra. Sự chênh lệch độ dẫn phụ thuộc vào nồng độ DNA. Nhược điểm của phương pháp này là không đo được khi nồng độ thấp hơn 10 nM/l. Kết hợp quá trình làm giàu bằng từ trường như trình bày ở trên và vi cảm biến độ dẫn có thể xác định được DNA có nồng độ thấp hơn. Hình 3 cho thấy sự phụ thuộc của nồng độ DNA vào thể tích của dung dịch ban đầu trước và sau khi làm giàu DNA. Nồng độ tăng tuyến tính theo thể tích cho thấy quá trình làm giàu DNA bằng từ tính đạt hiệu quả. Giá trị đo được bằng vi cảm biến độ dẫn không sai khác nhiều so với giá trị ước tính từ sự giảm thể tích ban đầu về 0,1 ml cho thấy hầu hết phân tử DNA trong dung dịch ban đầu (nồng độ 0,1 nM/l) đều lai hóa với hạt nano từ tính và được cô đặc bằng tách lọc từ. Đây là một phương pháp có thể sử dụng để mở rộng để xác định sự có mặt của nhiều loại siêu vi khác như siêu vi cúm gia cầm.

ĐẾM TẾ BÀO BẠCH CẦU CD4+ T

Quá trình gắn với kháng thể antiCD4 được thực hiện bằng cách lấy 0,4 g amino-NP rửa và tách từ hai lần bằng 1 ml dung dịch đệm 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES) có pH bằng 6 với nồng độ 0,1 M (Sigma). Sau đó, amino-NP được phân tán trong 0,25 ml dung dịch đệm chứa MES và 2 mg EDC ở dạng bột bằng cách khuấy đều tại nhiệt độ phòng trong 15 phút. Tách rửa bằng từ trường hai lần trước khi nhỏ 1 μg - 100 μg kháng thể đơn dòng antiCD4 (antiCD4, Invitrogen). Tách rửa từ 4 lần bằng nước cất ta thu được hạt nano gắn kháng thể antiCD4, kí hiệu là antiCD4-NP (hình 4). Trong một số mẫu, chúng tôi sử dụng 20 μl kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang (viết tắt là *antiCD4, bước sóng kích thích 480 nm, bước sóng Text Box:   Hình 3. Sự phụ thuộc của nồng độ DNA vào thể tích của dung dịch ban đầu trước khi và sau khi làm giàu DNA.phát xạ 520 nm của hãng Exiobio) trộn với antiCD4 có các nồng độ khác nhau. Sau 2 giờ các hạt nano được bọc bởi các kháng thể đơn dòng antiCD4 và *antiCD4 được tách rửa từ 3 lần bằng 1 ml dung dịch đệm phosphate saline (PBS). Kết quả cuối cùng ta thu được hạt nano từ bọc bởi hai loại kháng thể đơn dòng antiCD4: một loại thường (antiCD4-NP) và một loại phát huỳnh quang (*antiCD4-NP) và được bảo quản trong PBS bổ sung thêm albumin huyết thanh bò (BSA).

Lấy 200 μl máu của người bình thường được li tâm trong ống nghiệm Eppendorf 1,5 ml với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ huyết thanh rồi hòa lại vào 200 μl PBS bổ sung 1% BSA. Sau đó các ống được ủ với 0,2 mg antiCD4-NP và *antiCD4-NP trong 20 phút tại nhiệt độ phòng. Bổ sung 1,3 dung dịch đệm nhược trương (5 mM Tris pH 7.0, 10% glycerol) để đột ngột phá tung màng tế bào máu làm tế bào trở thành dạng không có bào quan và bào tương hay còn gọi là tế bào ma (ghost cell). Giai đoạn này, các antiCD4-NP và *antiCD4-NP trên bề mặt hạt nano sẽ gắn đặc hiệu lên các tế bào bạch cầu CD4+ T thông qua tương tác kháng nguyên-kháng thể và được tách lọc bằng từ trường, giúp loại bớt các tế bào ma. Trong một thí nghiệm đối chứng, chúng tôi gắn trực tiếp 20 μl kháng thể đơn dòng antiCD4 phát huỳnh quang với 200 μl máu để nhuộm tế bào bạch cầu CD4+ T. Quá trình xử lý tiếp theo cũng tương tự như thí nghiệm với antiCD4-NP và *antiCD4-NP nhưng không có bước tuyển từ. Các tế bào sau phản ứng gắn đặc hiệu với kháng thể được bảo quản trong 50 μl PBS lạnh, bổ sung 1% BSA và 10% glycerol. 5μl dung dịch chứa tế bào được nhỏ lên một tấm kính (slide glass) rồi được phủ lên bằng một phiến kính mỏng (cover slip) để quan sát bằng hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axio. Cường độ huỳnh quang được xử lí bằng phần mềm Scion Image.

Hình 5 là ảnh chụp các tế bào trong máu từ kính hiển vi dưới ánh sáng thường (H. 5. A, C) và dưới chế độ phát huỳnh quang (hình 5. B, D) (ánh sáng kích thích 480 nm, ánh sáng huỳnh quang 520 nm). Với mẫu không được tuyển từ (H. 5. A), dưới ánh sáng thường có thể nhìn thấy tế bào hồng cầu và nhiều loại tế bào bạch cầu. Sự nhận biết loại tế bào có thể thông qua hình dạng của chúng. Dưới chế độ huỳnh quang (H. 5. B) thì chỉ nhìn thấy tế bào bạch cầu CD4+ T mà không nhìn thấy các tế bào hồng cầu và bạch Text Box:   Hình 4. Quy trình tiếp hợp hạt nano được chức năng hóa với kháng thể antiCD4. Phản ứng (A) Hạt nano từ tính được chức năng hóa EDC. Phản ứng (B)Tiếp hợp kháng thể antiCD4 với hạt nano từ tính được bao phủ bởi EDC.cầu dạng khác. Sở dĩ như vậy vì hạt nano từ có kháng thể đơn dòng *antiCD4 rất đặc hiệu, chỉ gắn với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T và làm các tế bào này phát sáng. Độ sáng của tế bào bạch cầu đo được là (137±45)´103 (đơn vị tùy ý). Dựa trên diện tích của hình nghiên cứu vào khoảng 104 mm2, chúng tôi ước tính số tế bào bạch cầu CD4+ T của hai người trưởng thành là 670 và 810 tế bào/ml. Giá trị này nằm trong khoảng an toàn đối với người khỏe mạnh (600 đến 1200 tế bào/ml). Với người mắc bệnh HIV, số lượng tế bào bạch cầu giảm đi rất nhiều (thậm chí ít hơn 150 tế bào/ml) nên việc lấy thống kê theo diện tích trên hình quan sát của kính hiển vi không chính xác. Chính vì thế chúng tôi sử dụng hạt nano từ tính chức năng hóa bằng kháng thể antiCD4 để làm giàu tế bào bạch cầu trước khi đếm bằng hiển vi huỳnh quang. Chúng tôi đã thử nghiệm với các nồng độ antiCD4 khác nhau từ 1 mg – 100 mg và thấy rằng 20 mg là đủ để chức năng hóa bề mặt của 0,4 g hạt nano. Hình 5. C cho thấy ảnh chụp tế bào máu sau khi tách từ. Không giống như hình 5.A, hình này không có nhiều tế bào hồng cầu, tiểu cầu hoặc các tế bào bạch cầu loại khác với bạch cầu CD4+ T. Hơn nữa, tín hiệu thu được dưới chế độ ảnh chụp huỳnh quang (H. 5. D) cho thấy cường độ phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu CD4+ T mạnh hơn cường độ huỳnh quang của tế bào được tiếp hợp với kháng thể huỳnh quang mà không có hạt nano. Cường độ đo được là (356±64)´103 (đơn vị tùy ý) gấp 2,6 lần cường độ lần trước. Các kết quả trên cho thấy rằng, quá trình tách lọc tế bào sử dụng tương tác kháng nguyên-kháng thể đã thành công. Không những thế, cường độ huỳnh quang của các tế bào có hạt nano lại mạnh hơn trường hợp không có hạt nano. Điều này có thể giải thích như sau: nếu không có hạt nano, chỉ có một lớp kháng thể huỳnh quang bám trên bề mặt tế bào nên cường độ huỳnh quang chỉ do một lớp đó phát ra; trong trường hợp của hạt nano huỳnh quang, hạt nano có tác dụng “thu thập” các kháng thể huỳnh quang trước khi tiếp hợp trên bề mặt tế bào tạo nên nhiều lớp kháng thể huỳnh quang nên độ sáng lớn hơn độ sáng của một lớp kháng thể. Ngoài ra việc đếm Text Box:   Hình 5. Ảnh chụp các tế bào trong máu từ kính hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C) và dưới chế độ phát huỳnh quang (B, D) của tế bào không được bao bọc bởi hạt nano từ tính (A, B) và được bao bọc bởi hạt nano từ tính (C, D).tế bào cũng dễ dàng hơn do không bị lẫn với các tế bào khác loại và có nhiều tế bào trên một đơn vị diện tích nên thống kê chính xác hơn. Phương pháp đánh dấu tế bào kết hợp với tuyển từ như thế này rất hiệu quả trong việc đếm tế bào bạch cầu CD4+ T cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV.

XỬ LÍ NƯỚC BỊ NHIỄM BẨN

Ngoài những ứng dụng trong sinh học, các hạt nanô từ tính còn được ứng dụng trong xử lí nước bị ô nhiễm và hấp thụ thạch tín trong nước. Đối với hạt ôxít sắt, đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy các hạt này có khả năng hấp phụ ion độc hại trong nước, trong đó có thạch tín. Nguyên lí hấp phụ ở đây là tĩnh điện. Hạt nano khi trong môi trường dung dịch phù hợp sẽ có điện tích bề mặt. Với hạt magnetite, ở pH trung tính thì bề mặt của hạt sẽ mang điện tích âm. Điện tích âm sẽ hút các ion thạch tín mang điện tích dương lên bề mặt. Tuy nhiên, hạt nano không giúp cho việc xử lí các chất thải rắn lơ lửng trong nước. Nghiên cứu của chúng tôi cũng tập trung vào khả năng hấp phụ thạch tín lên bề mặt hạt nano magnetite. Tuy nhiên có những điểm khác biệt sau. Thứ nhất, magnetite dễ bị ôxi hóa nên từ tính giảm, nếu dùng quá trình tách từ sẽ kém hiệu quả, việc thay thế một phần Fe2+ bằng các ion kim loại khác như Ni hoặc Co trong magnetite sẽ làm giảm khả năng ô xi hóa mà vẫn không làm thay đổi đến khả năng hấp thụ. Thứ hai là chúng tôi kết hợp với một phương pháp xử lí nước có từ lâu đời là phèn chua với hạt nano từ tính để gia tăng quá trình lắng đọng chất thải rắn lơ lửng và xử lí ion độc hại.

Các hạt nano Fe1-xCoxFe2O4 (mẫu Co) và Fe1-yNiyFe2O4 (mẫu Ni) (x, y = 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5) được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa giống như hạt magnetite. Chỉ khác ở chỗ, một phần muối FeCl2 được thay thế tương ứng bằng NiCl2 và CoCl2. Dung dịch nước có chứa 0,1 mg/l As3+ được tạo thành một cách nhân tạo. Trong mỗi thí nghiệm về khả năng hấp phụ asen của hạt nano, 100 ml dung dịch sẽ được khuấy với hạt nano bằng máy khuấy từ trong thời gian từ 1 – 60 phút ở nhiệt độ phòng. HCl được nhỏ vào trước khi khuấy để điều khiển pH của dung dịch. Sau khi khuấy, hạt nano từ tính được tách khỏi dung dịch bằng một thanh nam châm. Dung dịch được phân tích thành phần asen bằng phổ kế hấp thụ nguyên tử (AAS). Lí do nghiên cứu mẫu Ni và Co là khả năng chống ô xi hóa ở môi trường làm việc ngoài không khí [9]. Với thành phần x, y ³ 0,1, khả năng chống ôxi hóa của mẫu Co và Ni được cải thiện đáng kể. Trong các nghiên cứu, chúng tôi lấy tiêu chuẩn nồng độ thạch tín cho phép trong nước uống của Việt Nam là 0,01 mg/l. Đối với hạt magnetite, tại pH trung tính, chỉ cần 0,25 g hạt nano cho một lít dung dịch, khuấy trong 3 phút là đủ để giảm nồng độ thạch tín ban đầu à 0,1 mg/l xuống thấp hơn tiêu chuẩn cho phép. Giá trị này tăng hơn một chút khi có sự có mặt của Ni và Co. Cụ thể là khối lượng tối ưu cho ferrite Ni và Co là 0,50 với x, y = 0,1 và 0,2. Với nồng độ Ni và Co cao hơn nữa thì khả năng hấp phụ giảm đi rõ rệt. Hạt nano sau khi hấp phụ thạch tín ở pH trung tính được cho vào môi trường có pH = 13 thì xuất hiện quá trình giải thoát mạnh mẽ thạch tín khỏi bề mặt hạt nano do bề mặt lúc này tích điện dương. Sau khi tách lọc bằng từ trường, hạt nano có thể được tái sử dụng để hấp thụ thạch tín nhiều lần mà hầu như không thấy có sự khác biệt nào so với hạt chưa hấp phụ lần nào.

Một trong những phương pháp làm sạch nước lâu đời ở Việt Nam là dùng phèn chua (một hỗn hợp muối sulfate nhôm, kali). Sau khi hòa trong nước, muối bị thủy phân dưới dạng hydroxide dạng keo. Keo sẽ giúp quá trình kết tụ chất thải rắn lơ lửng trong nước xảy ra nhanh hơn dưới gia tốc trọng trường. Nếu khuấy hạt nano với nước rồi mới cho phèn chua thì cùng với sự giúp đỡ của một từ trường ngoài, hạt nano từ tính sẽ giúp quá trình gia tăng lắng đọng nhanh gấp 10 lần vì lúc này quá trình lắng đọng diễn ra dưới gia tốc trọng trường và gradient từ trường. Chính vì thế việc ứng dụng một thành quả của khoa học hiện đại là vật liệu nano và một phương pháp xử lí nước truyền thống là dùng phèn chua có thể được ứng dụng để hấp phụ io độc hại và lắng đọng chất thải rắn trong nước bị ô nhiễm ở nhiều vùng ở Việt Nam.

KẾT LUẬN

Việc ứng dụng hạt nano trong tách lọc DNA, đánh dấu và nhận biết tế bào, xử lí nước nhiễm bẩn đã được nghiên cứu thành công. Những nghiên cứu này tuy chỉ mới bắt đầu nhưng hứa hẹn những thành quả cụ thể, vừa mang tính ứng dụng cao, vừa mang tính học thuật sâu rộng. Phương pháp chế tạo đơn giản, không đắt tiền rất phù hợp với điều kiện của Việt Nam.

Lời cám ơn

Công trình này được hỗ trợ về tài chính của đề tài Khoa học Cơ bản cấp nhà nước mã số 406506, đề tài cấp Đại học Quốc gia mã số QT-07-10 và dự án Selectnano-TTC của Cộng đồng Châu Âu.

Tài liệu tham khảo

[1] C. P. Poole, F. J. Owens, Introduction to nanotechnology, Wiley: Hoboken (2003).

[2] J. S. Murday, Nanomaterials–the driving force, AMPTIAC Newsletter 6 (2002) 20-29.

[3] http://nobelprize.org/

[4] R. C. O’Handley, Modern magnetic materials: principles and applications, Wiley: New York (2000) p. 307, 718.

[5] D. L. Leslie-Pelecky, V. Labhasetwar, J. Kraus, Nanobiomagnetics, trong Advanced magnetic nanostructures, D.J. Sellmyer, R.S. Skomski, Kluwer: New York (2006).

[6] Pankhurst, Q.A., J. Connolly, S.K. Jones, J. Dobson, Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine, J. Phys. D: Appl. Phys., 36 (2003) R167-R181.

[7] N. T. Khuat, V. A. T. Nguyen, T.-N. Phan, C. V. Thach, N. H. Hai, N. Chau, Extension of inhibitory effect of Chloramphenicol on bacteria by incorporating it into Fe3O4 magnetic nanoparticles, J. Korean Phys. Soc. (2007) to be published.

[8] N. H. Hai, C. V. Thach, N. T. Ha, N. Chau, N. T. V. Anh, P. T. Nghia, H. D. Chinh, Preparation of Fe3O4 magnetic fluids and their applications in biology and environment, Proc. Intl. Conf. Engineer. Phys., Hanoi (2006) 95-100.

[9] N. H. Hai, N. D. Phu, N. H. Luong, N. Chau, H. D. Chinh, L. H. Hoang, D. L. Leslie-Pelecky, Mechanism for Sustainable Magnetic Nanoparticles under Ambient Conditions, J. Korean Phys. Soc. (2007) to be published.

[10] I. J. Bruce, T. Sen, Surface modification of magnetic nanoparticles with Alkoxysilanes and their application in magnetic bioseparations, Langmuir 21 (2005) 7029-7035.

[11] M. A. Tuan, N. H. Binh, P. D. Tam, N. D. Chien, Conductometric biosensor for diabetic diagnosis and DNA detection in transgenic corn, Comm. Phys. 15 (2005) 218-222.

37 comments:

Nam Hy Hoàng Phong said...

Chao thay Nguyen Hoang Hai!

Duoc biet thay nghien cu & giang day ve nanotechnology, nen qua that quy hoa khi gap dung nguoi de hoi ve nghia cua tu "Nanoscopic", mong thay giai dap giup.

Da ta!

Da Trach said...

Nanoscopic la kich thuoc nano, thang nano. DT

Lin Huang said...

abercrombie and fitch new york
gucci
coach outlet store online
coach factory outlet
abercrombie
coach outlet
michael kors outlet online
christian louboutin outlet
hollister kids
air jordan 13
lebron james shoes
prada uk
gucci outlet
abercrombie store
hollister clothing store
toms outlet
michael kors purse
kobe shoes
beats solo
kate spade
lebron james shoes
michael kors
louis vuitton outlet
michael kors outlet
insanity workout
cheap jordans
jordan 11
coach factory outlet
true religion jeans
ralph lauren outlet
louis vuitton
coach factory outlet online
michael kors outlet
jordan 11s
chanel handbags
ray ban outlet
chi flat iron
tory burch outlet online
mulberry uk
true religion jeans
caihuanglin20150612

Gege Dai said...

15.07.23fangyanting
michael kors
louis vuitton borse
michael kors outlet online
abercrombie and fitch
longchamp pliage pas cher
tory burch outlet
longchamp pliage
ralph lauren uk outlet
christian louboutin shoes
prada shoes
kate spade new york
ray-ban sunglasse
mcm bags
coach outlet online
ray ban wayfarer
true religion
coach outlet
louboutin femme
polo ralph lauren
michael kors outlet
burberry sale
gucci belt
burberry scarf
abercrombie & fitch
jorda femme pas cher
michael kors outlet
prada outlet
nike pas cher
coach factory outlet
louboutin pas cher
michael kors handbags
football jerseys
cheap oakley sunglasses
ralph lauren polo shirts
michael kors handbags

Meiqing Xu said...

15724meqing
louis vuitton outlet
michael kors purse
louis vuitton handbags
hollister
timberlands
gucci outlet online
louis vuitton outlet
jordan 11 columbia
michael kors outlet online
abercrombie outlet
christian louboutin
abercrombie
coach outlet
jordan concord 11s
louis vuitton
jordan 13
louis vuitton
oakley sunglasses
retro 9
michael kors handbags
hollister co
toms shoes
discount oakley sunglasses
burberry outlet
rolex watches outlet
red timberland boots
michael kors outlet online
fitflops sale clearance
christian louboutin sale
lebron james shoes
oakley vault
burberry outlet online
christian louboutin shoes
michael kors handbags
hollister
true religion outlet
christian louboutin shoes
louis vuitton outlet
coach factory outlet
coach factory

Elvin Farrin said...

Very interesting article. I would love to read the book “Start with Why”, by Simon Sinek. I think he has taken a great topic to deal with. Teaching leaders to inspire others is a good idea to bring up a civilized society. Thanks for sharing. Keep posting.
Free Home Deposit |

Free Stone Homes |

Home Run Lotto |

At Automotive |

Automotive you Go |

Auto Dalmacija |

Auto Gross Store |

Auto Mazione |

Auto Nomyla |

Auto Reisen |

Milla Brain said...

Great article Lot's of information to Read...Great Man Keep Posting and update to People..Thanks 
Wasilla Wedding |

Custom Image Wedding |

Wedding Cake Cork |

The Wedding Chair |

Wedding Picture |

Color Wedding Day |

NY Wedding for You |

Wedding Videos |

Albany Wedding Pages |

Food Festivals |

nimi parker said...

Great tips and very easy to understand. This will definitely be very useful for me when I get a chance to start my blog. Thanks for sharing such a great content with us.
http://www.kinggyrostruck.com |

http://www.autotronicseldh.com |

http://www.kieslerautosucks.com |

http://www.truckfirelawyer.com |

http://www.graduacaonoexterior.com |

http://www.howtogreenyourhouse.com |

http://www.timehousebrands.com |

http://www.solarpanelsonhouse.com |

http://www.1890carolinehousebnb.com |

http://www.homesalespotomac.com |

Abigail Alexandra said...

I've seen your awareness about this theme whenever you post it and it really gives an informational message to us readers. I am hoping that you'll continue writing this kind of blog. Thanks for sharing this information.
http://www.fijibeachouse.org |

http://www.minimalhome.org |

http://www.theseedhome.org |

http://www.stayhomeadaptation.org |

http://www.capassivehouse.org |

http://www.realestateinthepearl.org |

http://www.cresrealestate.org |

http://www.tma-realestate.org |

http://www.bendorrealestate.org |

http://www.realestatemarketnews.org |

Aiken Barlow said...

Nice work, nice work.
pro-autogas.com |

pemaauto.com |

toyotacarsstlouis.com |

autoscoloris.com |

pwautosales.com |

justselclasscars.com |

justpopularcars.com |

showcarsupplyauto.com |

greersautomotive.com |

vsp-auto.com |

Julie Wilson said...

I’d love to change the spell icons, if anyone is willing to contribute art for credit then I will change it asap. I don’t think I can get sued given that it’s for non-commercial purposes but I’m not a lawyer.
automazione-net |

autonomyla |

autoreisenzug |

autosalesdude |

autoskolavatmar |

autottk |

autoverkade |

bellvilleauto |

complete-auto |

lowermyautorate |

Jonny Thomas said...

I’d love to change the spell icons, if anyone is willing to contribute art for credit then I will change it asap. I don’t think I can get sued given that it’s for non-commercial purposes but I’m not a lawyer.
boulder-vision-care |

serenelovingcare |

c3caregiver |

2lifesmiledentalcare |

health-of-migrants |

blackamericafitness |

mccfitnessstems |

fitnessorange |

doubletweightloss |

urbanfitnessgroup |

Xianjun Ranqin said...

qihang0921,belstaff
football shoes
kate spade uk
abercrombie and fitch
nike sb
ugg slippers
instyler curling iron
timberland uk
canada goose uk
jordan shoes
fitflops sale clearance
nike roshe runs
ghd hair straighteners
toms outlet
vans shoes
adidas original trainers
coach outlet store online
ralph lauren pas cher
fake oakleys
tod's shoes
fake oakley sunglasses
nike air max
new balance outlet
gucci borse
nike roshe run
pandora jewelry
air max
louboutin
michael kors
kobe bryant shoes
adidas superstars
kate spade
nike elite socks
ed hardy uk
adidas originals
pandora charms
north face
cheap oakleys
q

Junda Xu said...

20151026 junda
michael kors outlet
louis vuitton outlet
nfl jerseys
cheap ugg boots
Coach Factory Outlet Online Sale
air max 95,nike golf,nike janoski,air max 1,nike canada,nike plus,nike shox,nike factory store
Louboutin Red Bottoms Shoes Outlet
oakley sunglasses
louis vuitton outlet
ralph lauren polo
michael kors outlet
michael kors outlet sale
ugg boots
Authentic Louis Vuitton Handbags Cheap Online
mont blanc
michael kors outlet
Gucci Outlet Online Sale
michael kors handbags
Authentic Louis Vuitton Belts Outlet Store
michael kors outlet
Coach Factory Outlet Private Sale
true religion jeans
tory burch outlet
Oakley Vault Outlet Store Online
hollister clothing store
nike trainers
Louis Vuitton Handbags Official Site
michael kors handbag
Louis Vuitton Handbags Factory Store
uggs australia

柯云 said...

2016-01-09keyun
cheap ugg boots
louis vuitton outlet
louis vuitton bags
oakley sunglasses
cheap tods
uggs for men
tory burch shoes
oakley sunglasses
michael kors outlet
hollister kids
michael kors outlet clearance
nike huarache white
cheap ray ban sunglasses
kobe 8
coach clearance
cheap air jordans
louis vuitton outlet stores
jordan shoes
ugg boots outlet
cheap oakley sunglasses
timberlands
michael kors outlet
celine handbags
coach outlet
michael kors outlet
louis vuitton purses
ray ban outlet
coach outlet
canada goose outlet online
fake oakley sunglasses
uggs outlet
canada goose coats
ugg australia outlet
nfl jerseys wholesale
hollister kids
coach outlet
christian louboutin shoes
louis vuitton bags
gucci outlet

chenlili said...

chenlili20160324
the north face jackets
christian louboutin sale
hollister jeans
oakley store
ghd hair straighteners
nike roshe run mens
ugg outlet
ugg for cheap
copy watches
kate spade outlet
tory burch flats
louis vuitton uk
nike free 5.0
louis vuitton bags
coach outlet online
kate spade outlet
nfl jerseys
jordan retro 4
toms outlet
michael kors outlet
ralph lauren outlet
fit flops
nike trainers sale
coach outlet online
kate spade purses
louis vuitton outlet
tods outlet store
gucci handbags
vans sneakers
louis vuitton
burberry sale
replica rolex watches
jordan 3s
oakkey sunglasses
michael kors outlet
michael kors outlet

Anonymous said...

Hello,I love reading through your blog, I wanted to leave a little comment to support you and wish you a good continuation. Wishing you the best of luck for all your blogging efforts. http://www.crearebusiness.net |

Anonymous said...

I am very happy to discover your post as it will on top in my collection of favorite blogs to visit.http://www.carsoncitysalarmy.net |

Anonymous said...

I like this post. It's quite unusual and innovative. Writer might be really gorgeous. Someone could easily claim that he is a genius. http://www.lighthousegalley.net |

Anonymous said...

well, this is an amazing thing that I found here. You tried best to achieve your thoughts. http://www.nc-technology.net |

Anonymous said...

Thank you for another great article. Where else could anyone get that kind of information in such a perfect way of writing? I have a presentation next week, and I am on the look for such information. http://www.healthbenefitsabcs.net |

Anonymous said...

Hello,I love reading through your blog, I wanted to leave a little comment to support you and wish you a good continuation. Wishing you the best of luck for all your blogging efforts. http://www.notetakingsoftware.org |

Anonymous said...

This is my first time visit here. From the tons of comments on your articles,I guess I am not only one having all the enjoyment right here!http://www.newbusinessmath.com |

Anonymous said...

You actually make it seem so easy with your presentation but I find this topic to be really something which I think I would never understand. It seems too complicated and very broad for me. I am looking forward for your next post, I will try to get the hang of it!http://www.demonhouse.org |

Anonymous said...

I like this post. It's quite unusual and innovative. Writer might be really gorgeous. Someone could easily claim that he is a genius. http://www.businesstalkradio.org |

Anonymous said...

well, this is an amazing thing that I found here. You tried best to achieve your thoughts. http://www.upgradetravelbetter.org |

Emma Hardy said...

Quality content is the crucial to invite the visitors to visit the site, that's what this website is providing.http://www.assistmeditechclients.com |

Anonymous said...

Excellent. one of the best articles I have every read. This is the information which I have been searching. Great information.http://www.stlweddings.org |

Abigail Alexandra said...

I like you recommendation. Your recommendation is of well use to people. A great article post, this is something very interesting. I really appreciate your post.http://www.autoinjurywis.com |

loren Jett said...

I am really satisfied with this posting that you have given us. This is really a stupendous work done by you.http://www.2lifesmiledentalcare.com |

Anonymous said...

I've just decided to create a blog, which I have been wanting to do for a while. Thanks for this post, it's really useful!http://www.adenium-shopping.org |

xjd7410@gmail.com said...

coach factory outlet
toms outlet
louis vuitton handbags
louis vuitton purses
cheap nfl jerseys
michael kors handbags
michael kors outlet
michael kors outlet
cheap oakley sunglasses
juicy couture
ralph lauren outlet
coach factory outlet online
hermes outlet
toms outlet
tods outlet online
ralph lauren polo
rolex watches
coach factory outlet
kate spade handbags
ray ban sunglasses
polo ralph lauren outlet
kate spade outlet
nike air max uk
polo ralph lauren
louis vuitton handbags
michael kors outlet clearance
nike air max 90
timberland outlet
ghd flat iron
michael kors outlet clearance
chenyingying2016716

Unknown said...

oakley sunglasses
cheap mlb jerseys
tiffany jewellery
north face jackets
ralph lauren polo shirts
nike roshe run
nfl jerseys wholesale
canada goose jackets
louis vuitton outlet stores
swarovski crystal
chanyuan11.24

van tuan said...

chung cư vinhomes nguyễn trãi abc
chung cu vinhomes nguyen trai xcb
vinhomes nguyen trai bcz
vinhomes nguyễn trãi abx
vinhome nguyễn trãi 2ds
vinhome nguyen trai hsk
vincom nguyễn trãi qut
vincom nguyen trai ujk
chung cư vinhomes nguyễn trãi abx
chung cu vinhomes nguyen trai acx
vinhomes nguyen trai adx
vinhomes nguyễn trãi edx
vinhome nguyễn trãi edc
vinhome nguyen trai edf
vincom nguyễn trãi rdk
vincom nguyen trai rkd

van tuan said...

dự án chung cư vinhomes nguyễn trãi là một quần thể đô thị hiện đại chung cu vinhomes nguyen trai được trang bị nội thất tinh tế thiết kế vinhomes nguyễn trãi sang trọng vinhomes nguyen trai đẳng cấp kết hợp cùng tiện nghi vinhome nguyen trai cao cấp vinhomes nguyễn trãi là điểm đến lý tưởng vincom nguyen trai đầy đủ cho người tiêu dùng vincom nguyễn trãi có bán giày nam các loại giày công sở nam đẹp nhất

nora nor said...

I'm going to highly recommend this web site
http://www.kuwait.prokr.net/
http://www.emirates.prokr.net/

aaa kitty20101122 said...

yeezy shoes
asics running shoes
atlanta falcons jersey
nike air huarache
pandora charms
tom ford sunglasses
nike roshe run
lebron 13
curry shoes
cheap jordans